アンブレラ社の地下秘密研究所「ハイブ」でのバイオハザード発生から2日後、その真上にあるラクーンシティでは住民達がいつもと変わらぬ日常を送っていた。しかし、ハイブで起きた事件を調査すべく派遣されたアンブレラ社の社員が封鎖された地下入り口を開けると、高濃度のウイルス反応が検知され調査隊は内部から出てきたクリーチャーによって襲われてしまう。その結果、ウイルスによる汚染が街にまで蔓延し人々は次々と感染してゾンビ化、街中で人を襲い始めてアンデッド達が溢れ出し、壊滅状態になった。事件の隠蔽を図るアンブレラ社はラクーンシティを封鎖する。

息子を交通事故で亡くしたジェフは、目覚めると食肉工場の地下室にいた。扉を開けると、そこには鎖につながれた3人の男女。最愛の息子を飲酒運転でひき殺した男、犯人に軽罪しか与えなかった判事、そして事故を目撃しながら証言しなかった女…。「俺は、息子を殺した人間たちを処刑するのか？」　一方、医者のリンは誘拐され、連れて行かれた地下室で、瀬戸際のジグソウと会う。彼の延命手術を成功させなければ、彼女にも死が待っている…。こうして新たなる「ゲーム」が始まった！

ジグソウと弟子アマンダは死んだ。ジグソウ最後のゲーム現場でパズルを解こうと奮闘するホフマン刑事。ケリー刑事殺害のニュースを聞いたFBIからストラム捜査官とペレーズ捜査官も駆けつける。しかしその頃、ジグソウに関わって唯一生き残っていたSWATのリッグが、新たなゲームに強制参加させられていた。与えられた時間は90分。すべての罠をクリアして旧友を救うことが出来るのか、それとも地獄の結末を迎えるのか。このゲームを操っているのは何者なのか？